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Jun 23, 2023

mRNA administrado por via intradérmica

Natureza Engenharia Biomédica

Nature Biomedical Engineering (2023) Citar este artigo

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O sucesso da terapêutica do RNA mensageiro depende em grande parte da disponibilidade de sistemas de entrega que permitem a tradução segura, eficaz e estável do material genético em proteínas funcionais. Aqui, mostramos que as vesículas extracelulares (EVs) produzidas por nanoporação celular a partir de fibroblastos dérmicos humanos e encapsulando o mRNA que codifica o colágeno α1 tipo I da matriz extracelular (COL1A1) induziram a formação de enxertos de proteína de colágeno e reduziram a formação de rugas no colágeno. tecido dérmico empobrecido de camundongos com pele fotoenvelhecida. Também mostramos que a entrega intradérmica dos EVs carregados com mRNA por meio de uma matriz de microagulhas levou à síntese prolongada e mais uniforme e à substituição de colágeno na derme dos animais. A entrega intradérmica de mRNA COL1A1 baseado em EV pode ser uma terapia de reposição de proteína eficaz para o tratamento da pele fotoenvelhecida.

Desenvolvimentos recentes em técnicas de modificação de RNA mensageiro aumentaram a eficiência terapêutica da entrega de mRNA e seu potencial para aplicações clínicas de curto prazo, incluindo terapia de reposição de proteínas e vacinação contra o vírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2)1, 2. No entanto, a incapacidade intrínseca e a potencial imunogenicidade dos mRNAs exigem que eles sejam encapsulados em veículos de entrega. As modalidades atuais de entrega de mRNA centram-se no uso de transportadores de nanopartículas lipídicas (LNP) para encapsulamento e transporte3,4. No entanto, as LNPs apresentam vários desafios importantes, incluindo citotoxicidade, má biodistribuição, falta de especificidade do alvo e imunogenicidade. Esses problemas podem ser causados ​​pela necessidade de PEGilação de superfície (PEG significa poli(etilenoglicol)) de LNPs para melhorar sua meia-vida circulatória e reduzir a depuração não específica5,6. Notavelmente, a administração de LNPs em pessoas tem sido associada a anafilaxia, hipersensibilidade e eventos adversos autoimunes7,8. Portanto, a identificação de transportadores de mRNA que podem superar alguns desses desafios associados a LNP seria útil para o desenvolvimento de terapias baseadas em mRNA.

As vesículas extracelulares (EVs), incluindo exossomos e microvesículas, desempenham um papel importante no transporte de biomoléculas e ácidos nucléicos, incluindo mRNAs, dentro do corpo humano9,10,11. Como resultado, nos últimos anos, os EVs surgiram como veículos promissores para terapias baseadas em ácidos nucleicos devido à sua biocompatibilidade intrínseca, sua capacidade de atravessar barreiras fisiológicas e sua baixa imunogenicidade12,13. Ao contrário dos LNPs, os EVs, incluindo os exossomos, são produzidos endogenamente pelas células do corpo e levam a níveis mais baixos de respostas inflamatórias. Além disso, foram desenvolvidas estratégias para produzir grandes quantidades de exossomos de forma barata e fácil. Relatamos anteriormente um método de nanoporação celular (CNP) no qual poros nanométricos transitórios foram criados na superfície das células de origem para permitir o carregamento em larga escala de mRNAs transcritos completos em EVs14 secretados. Aqui, usando um modelo de rato de fotoenvelhecimento agudo que imita de perto as características fisiopatológicas da pele danificada pelo envelhecimento em humanos15, mostramos a utilidade da terapia de mRNA COL1A1 baseada em exossomos para substituir a perda dérmica de proteína de colágeno como um tratamento antienvelhecimento para fotoenvelhecimento pele. Para melhorar a eficiência da entrega e retenção de mRNA, também mostramos que a entrega de mRNA de colágeno por meio de um adesivo de microagulha de ácido hialurônico (HA) (COL1A1-EV MN) permite uma distribuição mais eficiente de mRNA na derme, resultando em colágeno durável -enxerto de proteína e em um melhor tratamento de rugas na pele fotoenvelhecida.

A atrofia dérmica devido à perda irreversível de colágeno é uma característica do envelhecimento da pele16,17. Numerosos métodos visam restaurar a perda de proteína de colágeno na pele, variando de abordagens farmacêuticas e de venda livre (antioxidantes18,19,20, retinóides21, peptídeos22,23) a dispositivos médicos (isto é, terapia a laser24 e preenchimentos dérmicos sintéticos25,26) . No entanto, nenhuma dessas tecnologias existentes foi capaz de alcançar a reposição endógena de colágeno a longo prazo para manter a força, firmeza e elasticidade da pele ao longo do tempo27,28,29. A estimulação de fibroblastos responsáveis ​​pela síntese de proteínas de colágeno também pode ser uma forma eficaz de controle a curto prazo do envelhecimento da pele30. No entanto, os fibroblastos perdem gradualmente sua capacidade de proliferar e sintetizar colágeno à medida que envelhecem, resultando em desafios para métodos de reposição de colágeno de longo prazo para tratamento antienvelhecimento31. Para superar essas limitações, buscamos substituir a proteína de colágeno em um modelo de fotoenvelhecimento de colágeno por meio da entrega de mRNA mediada por EV. Para gerar EVs carregados com mRNA de colágeno humano I alfa I (COL1A1), empregamos uma técnica de CNP que envolveu o revestimento de uma monocamada de fibroblastos dérmicos humanos neonatais (nHDFs) em uma superfície de nanoporos e a nanotransfecção das células com um plasmídeo COL1A1-GFP ( Fig. 1a e Fig. Complementar 1a)14. Os EVs foram isolados do meio de cultura no dia seguinte à transfecção. Verificou-se que as células tratadas com CNP têm um número EV 10 vezes maior por célula em comparação com as células tratadas com eletroporação em massa padrão (BEP), que foi realizada usando eletrodos paralelos do tipo cuvete, conforme descrito anteriormente32, ou nHDFs não tratados em cultura (Fig. .1b). Os EVs produzidos por cada método foram caracterizados por uma distribuição de tamanho com pico de cerca de 150 nm de diâmetro, conforme determinado pela análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) e 80% de intensidade no pico do modo por dispersão de luz dinâmica (DLS) (Fig. 1c e Suplementar Fig. 1b,c) com um índice de polidispersão (PDI) de 0,12–0,25. Experimentos de Western blot mostraram que as expressões de biomarcadores de exossomos (CD9, CD63, TSG101) e microvesículas (ARF6) no grupo tratado com CNP foram significativamente maiores do que no grupo não tratado, confirmando o aumento nos EVs secretados (Fig. Complementar. 1d). As análises cinéticas mostraram ainda que a liberação de EV otimizada por voltagem atingiu o pico em 8 h após a indução de CNP, com secreção contínua observada nas próximas 24 h (Fig. 1e, f suplementar). A reação em cadeia da polimerase quantitativa por transcrição reversa (RT-qPCR) mostrou que os EVs secretados por CNP continham mais de 200 vezes o mRNA de COL1A1 do que os EVs secretados por BEP e 3.000 vezes mais mRNA de COL1A1 do que os EVs secretados de células não transfectadas (Fig. 1d ). A avaliação do bioanalisador de gel de agarose demonstrou mRNA COL1A1 transcrito completo em ~ 4.000 nucleotídeos (Fig. 1e). As EVs preparadas por CNP exibiram estabilidade estrutural quando armazenadas para administração pré-clínica a 4 °C sem alterações nas propriedades de aparência, membrana e tamanho quando avaliadas por microscopia crioeletrônica (crio-EM), microscopia de força atômica (AFM) e NTA (Fig suplementar .2a–c). Além disso, o mRNA de COL1A1 encapsulado em EVs era estável tanto à temperatura ambiente quanto a 4 °C e também exibia estabilidade sérica, destacando assim seu potencial para utilidade clínica futura (Fig. 2d,e complementar).